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2016年8月20日/生物谷BIOON/--CRISPR-Cas9是一種用于在人細胞系中進行基因敲除來發(fā)現(xiàn)它們的基因所發(fā)揮何種功能的流行技術,但是讓基因失去功能的效率存在非常大的差異。
如今,在一項新的研究中,來自美國加州大學伯克利分校的研究人員在大多數(shù)類型的人細胞中,發(fā)現(xiàn)一種方法讓CRISPR-Cas9切割靶基因和讓它們失去功能的效率提高高達5倍,從而能夠更加容易構建和研究基因敲除細胞系以及潛在地作為一種人類療法讓一個發(fā)生突變的基因失去功能。相關研究結果于2016年8月17日在線發(fā)表在Nature Communications期刊上,論文標題為“Non-homologous DNA increases gene disruption efficiency by altering DNA repair outcomes”。
科學家們不斷發(fā)現(xiàn)新的基因或它們編碼的蛋白,但是很難發(fā)現(xiàn)它們在體內(nèi)或在疾病中發(fā)揮的作用。發(fā)現(xiàn)這種作用的關鍵是讓基因失去功能來觀察當它被移除時會發(fā)生什么。
盡管CRISPR-Cas9能夠加快制造基因敲除細胞系的過程,但是人們有時必需制造和篩選許多這種基因編輯器的變異體以便發(fā)現(xiàn)哪一種發(fā)揮得更好。在這項研究中,研究人員發(fā)現(xiàn)只需經(jīng)過簡單調(diào)整一下就能夠更加有效率地開展這個過程。
關鍵就是與CRISPR-Cas9分子一起被導入人細胞中的短片段DNA不與人基因組中的任何DNA序列相匹配。這些短片段DNA被稱作寡核苷酸,似乎干擾人細胞中的DNA修復機制,從而將比較普通的CRISPR-Cas9的基因編輯效率提高2.5到5倍。
論文通信作者、加州大學伯克利分校創(chuàng)新基因組計劃科技總監(jiān)、分子與細胞生物學兼任助理教授Jacob Corn說,“它表明如果你做了非常簡單的事情---只是將廉價的與人基因組不存在任何同源性的人工合成寡核苷酸導入到細胞中,那么基因編輯效率提高多達5倍?!边@種技術提高所有CRISPR-Cas9的編輯效率,即便是初始時完全不會起作用的那些CRISPR-Cas9。
利用這種更高的基因編輯效率,研究人員將會更加成功地構建他們想要的基因敲除細胞系,隨后利用這些基因敲除細胞系研究一個基因或一組基因的功能。鑒于大多數(shù)壽命長的人細胞系起源自癌細胞---包括非常流行的HeLa細胞系,這些細胞系通常含有多于正常時每個基因的兩個拷貝。這就使得一次敲除所有拷貝比較困難,因而更高的基因編輯效率會極大地增加這種成功機會。
當通過基因敲除校正人體內(nèi)的遺傳性基因突變時,較高的基因編輯效率也是必不可少的。醫(yī)生們猜測可將讓人們?nèi)菀谆忌螦IDS等傳染性疾病或者自身免疫疾病、炎性疾病或神經(jīng)退行性疾病的基因敲除掉。Corn和同事們描述的這種方法是否能夠用于疾病治療仍需拭目以待,但是就研究而言,它是非常有效的。
DNA修復是CRISPR-Cas9成功的關鍵
CRISPR-Cas9分子是由被稱作Cas9的蛋白剪刀和一種引導Cas9結合到DNA靶位點并在那里進行切割的向?qū)NA(gRNA)組成的。這種技術依賴于以下一個事實:當切割靶基因上的特異性DNA序列時,細胞的修復機制并不總是重建這種DNA鏈,而是在這種DNA序列上產(chǎn)生錯誤,從而讓這種基因失去功能和破壞它的活性。
這種gRNA是一種長20nt的RNA短鏈,與靶基因上的DNA序列互補。它結合到這種DNA序列上,讓Cas9切割這種雙鏈DNA。
為何一些gRNA發(fā)揮很好,讓Cas9能夠?qū)⒔?00%地切割靶基因并讓它失去功能,然而其他的gRNA能夠結合到靶基因上,但是很少或從不會敲除它?自從這個技術在2012年被來自加州大學伯克利分校的Jennifer Doudna和來自瑞典于默奧大學的Emmanuelle Charpentier發(fā)明以來,這一直就是個秘。Corn說,這種切割效率隨著細胞類型和特定細胞系的不同而發(fā)生變化。